|
http://www.abbs.info
e-mail:[email protected] ISSN 0582-9879
ACTA BIOCHIMICA et
BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(9): 841–846
CN 31-1300/Q |
Purification and
Characterization of Trichokirin-S1, a Novel Ribosome-inactivating Peptide from
Seeds of Trichosanthes kirilowii
LI Feng, YANG
Xin-Xiu, HU Wei-Guo, XIA Hen-Chuan, LI Zhen, ZHANG Zu-Chuan*
(Key Laboratory of Proteomics， Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China )
Abstract A
novel peptide from the seeds of Trichosanthes kirilowii, trichokirin-S1, was
purified by extraction of protein body, ammonia sulfate precipitation, Blue-gel
affinity chromatography, FPLC Mono S ion exchange chromatography and Superose12
gel filtration chromatography. Its molecular weight was determined to be 11 426
by MALDI-TOF MS analysis. Its reaction mechanism to inactive ribosome was the
same as that of the ribosome-inactivating protein trichosanthin, a rRNA
N-glycosidase. The purified trichokirin-S1 showed a strong inhibitory activity
on protein synthesis in cell-free rabbit reticulocyte lysate system, with IC50
of 0.7 nmol/L. Therefore, trichokirin-S1 may be a promising and efficient toxin
moiety of immunotoxins.
Key words trichokirin-S1;
translational inhibitory activity; rRNA N-glycosidase
栝楼籽中一种新的具有蛋白质生物合成抑制活性的多肽——Trichokirin-S1的分离、纯化和性质
李丰 杨欣秀 胡维国 夏恒传 李臻 张祖传*
( 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室， 上海 200031 )
摘要 改进了常规的核糖体失活蛋白的分离纯化方案， 首先采用抽提蛋白体的方法， 提高了分离效果， 然后再经硫酸铵分级沉淀、 FPLC Mono S阳离子交换层析和Superose12 凝胶过滤层析等步骤， 从栝楼种子中分离到一种新的多肽——trichokirin-S1。 经MALDI-TOF MS质谱分析测得其分子量为11 426。 该肽的N端氨基酸序列为PRRKEGGSFDECCSE， 与一种存在于南瓜籽中的小分子核糖体失活蛋白β-moschin具有很高的同源性。 trichokirin-S1对核糖体失活的机制与天花粉蛋白（TCS）一致， 是rRNA N-糖苷酶催化型的， 对兔网织红细胞裂解液系统蛋白质生物合成有较强的抑制作用， IC50为0.71 nmol/L， 因而有可能开发成免疫毒素的高效“弹头”。
关键词
trichokirin-S1； 翻译抑制活性； rRNA N-糖苷酶
植物种子中含有多种蛋白质和多肽， 其中有一类是具有抑制蛋白质生物合成活性的核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating protein, RIP）。 通常根据肽链的组成和性质， 植物核糖体失活蛋白分为三类［1］， Ⅰ型由单链构成， 分子量为25～30 kD， 具有N-糖苷酶活性， 能水解真核细胞核糖体RNA的4324位上的腺嘌呤， 从而抑制蛋白质的合成； Ⅱ型为双链型， 其中一条链具有与Ⅰ型相同的功能， 另一条链则具有凝集素活性， 两条链通过二硫键连接， 分子量约为60 kD； Ⅲ型RIP也由两条链组成， 它们由同一个前体蛋白加工而成， 通过非共价的相互作用结合在一起， 共同参与形成N-糖苷酶的活性中心， 分子量约为25 kD。
近年来， 又相继报道了多种存在于葫芦科植物的种子中的分子量约为10 kD的具有翻译抑制活性的多肽， 如Luffin S［2］、 γ-momorcharin［3］、
S-trichokirin［4］、 benincasin［5］、 moschin［6］等。 由于它们有分子小的优点，
并且有较强的抑制活性， 可能是理想的免疫毒素“弹头”。 我们从葫芦科植物栝楼籽中分离到一种新的具有翻译抑制活性的多肽，
命名为 trichokirin-S1。 已有的报道表明栝楼籽中存在多种大分子RIP， 它们都具有很强的翻译抑制活性。
由于trichokirin-S1存在于种子的蛋白质储存液泡（protein storage
vacuole)， 即蛋白体（protein body）， 本文改进了通常的纯化方案， 采用先抽提蛋白体的方法， 有效地减少了大分子RIP的干扰， 提高了纯化效率。 同时本文还对trichokirin S1的一些性质包括N端序列、 生物活性和作用机理等进行了研究。
1 材料和方法(Materials and Methods)
1.1 材料
栝楼（Trichosanthes kirilowii）籽采自中科院生化细胞所大院内； Wistar大鼠由中科院实验动物中心提供； 亲和凝胶蓝胶购自Bio-Rad公司； 兔网织红细胞裂解液按应文斌等［7］方法制备。 其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 栝楼籽蛋白体抽提液的制备 栝楼籽蛋白体的制备基本按文献［8］所述方法进行。 100 g去壳栝楼籽加入1000 ml 甘油， 在室温下用组织匀浆机匀浆。
匀浆液经过4层纱布过滤后，
在室温下13 000 g离心10 min， 沉淀用1000 ml甘油重悬后， 在室温下13 000 g离心10 min。 沉淀用200 ml 含1 mol/L NaCl 和 1 mmol/L EDTA的10 mmol/L Tris·Mes pH 6.5 缓冲液制成蛋白体悬液，
经超声破碎后， 于4 ℃， 53 000 g离心20 min。 取上清液（蛋白体抽提液）用硫酸铵分级沉淀，
取60％～100％饱和度的沉淀， 对10 mmol/L Tris·HCl pH 7.5缓冲液充分透析。
1.2.2 蓝胶亲和层析 透析后的样品上蓝胶柱（1 cm×8 cm）， 先用10 mmol/L Tris·HCl pH 7.5缓冲液洗去杂蛋白质， 然后用含1 mol/L NaCl的10 mmol/L Tris·HCl pH 7.5缓冲液洗脱亲和吸附的蛋白质和多肽。
合并洗脱的样品， 冻干后对10 mmol/L pH 4.6 乙酸缓冲液充分透析。
1.2.3 Mono-S阳离子交换层析 将经过blue gel柱亲和纯化的样品上10 mmol/L pH 4.6 乙酸缓冲液平衡的FPLC Mono S HR 5/5（Pharmacia）离子交换柱。 然后以0～0.8 mol/L
NaCl的10 mmol/L pH
4.6乙酸缓冲液进行梯度洗脱， 流速0.4 ml/min。 收集活性峰， 冻干后对10 mmol/L PBS（pH 7.2）进行透析。
1.2.4 Superose12
凝胶过滤层析 将上述样品上Superose12 HR 10/30 （Pharmacia） 凝胶过滤层析柱， 以10 mmol/L PBS（pH 7.2）缓冲液进行洗脱， 流速0.3 ml/min。 收集活性峰后冻干， 经Sephadex G-25脱盐后即为纯化的trichokirin-S1样品， 存于－20 ℃备用。
1.2.5 Trichokirin-S1的分子量测定 15％ Tris·Tricine SDS PAGE分析按文献［9］方法进行。 分子量测定在Bruker公司Reflex Ⅲ
MALDI-TOF 质谱仪上进行， 使用饱和芥子酸溶液作为基质。
1.2.6 Trichokirin-S1
N端氨基酸序列分析 trichokirin-S1的N端氨基酸序列分析在ABI公司491A 气相蛋白质序列分析仪上进行， 采用Edman降解法进行测定。
1.2.7 Trichokirin-S1对无细胞系统蛋白质生物合成的抑制活性的测定 按应文斌等［7］方法进行分析。
1.2.8 核糖体失活机制分析 大鼠肝核糖体按Spedding方法［10］制备，
核糖体失活机制的分析采用Endo等［11］方法。
2 结果（Results）
2.1 trichokirin-S1的分离纯化
栝楼籽蛋白体抽提液经硫酸铵分级沉淀， 取60％～100％饱和度硫酸铵沉淀的样品， 上蓝胶柱进行亲和层析［图1（A）］， 洗脱的样品经冻干透析后上FPLC Mono S柱进行阳离子交换层析， 收集P6峰［图1（B）］。
Fig.1 Purification
of trichokirin-S1 from seeds of Trichosanthes kirilowii
(A) Blue-gel affinity chromatography of
fraction from 60%－100%
saturated ammonia sulfate precipitation of crude protein body preparation. The
column was washed initially with the starting buffer (10 mmol/L Tris·HCl, pH
7.5) and then eluted with 1 mol/L NaCl in the starting buffer. (B) Mono S FPLC
of fraction obtained from blue-gel affinity chromatography. The column was
eluted with a 0－0.8 mol/L
NaCl gradient in 10 mmol/L sodium acetate buffer, pH 4.6. (C) Superose12 Gel
filtration chromatography of fraction P6 from Mono S FPLC. The black bar
represents fractions contain trichokirin-S1.
该峰经过Superose 12凝胶过滤层析进行进一步纯化， 得到两个峰［图1（C）］， 其中F1峰经15％Tris·Tricine PAGE鉴定为单一条带， 其分子量约为12 kD。 我们将这一多肽命名为trichokirin-S1。 最终从100 g栝楼籽中可以得到约2.6 mg纯的trichokirin-S1。 图2为不同纯化步骤样品的15％Tris·Tricine PAGE分析结果， 由图中1、 2泳道可见， 在蛋白体抽提液中存在于栝楼籽中分子量约为30 kD的蛋白成分含量很低， 这就有效地排除了单链RIP的干扰， 而trichokirin-S1在蛋白体抽提液中的含量非常高， 经硫酸铵分级沉淀得到的样品中主要成分是小分子的蛋白质和多肽。 蓝色染料Cibacron blue F3GA是一种结构类似于NAD＋的磺化多芳香环化合物， 能与含核苷酸结合部位的蛋白特异地结合， 蓝胶是以该染料为配基制成的一种亲和凝胶。 植物来源的RIP均以真核生物rRNA为底物， 有核苷酸结合部位， 因而可用蓝胶进行纯化。 图2的4泳道是蓝胶亲和层析后的样品。 最终获得的trichokirin-S1样品在15％Tris·Tricine PAGE胶中呈现为单一条带（图2， 泳道6）， 说明样品的纯度很高。
Fig.2 15% Tris·Tricine
SDS-PAGE of trichokirin-S1 preparations from different purification steps
1, protein standard molecular weight
markers; 2, crude extract of protein body from Trichosanthes kirilowii seeds;
3, 60%－100%
saturated ammonia sulfate precipitation of crude protein body extract; 4,
sample after blue gel affinity chromatography; 5, fraction P6 of Mono S FPLC;
6, trichokirin-S1 purified by Superose12 gel filtration chromatography.
2.2 Trichokirin-S1的分子量测定
通过Tris·Tricine PAGE分析， 根据标准蛋白质和样品在凝胶上的迁移率计算得到trichokirin-S1的分子量约为10 kD。 基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进一步测定trichokirin-S1的准确分子量为11 426 (见图3)。 另外， 质谱图还说明， 纯化的trichokirin-S1样品有很高的纯度。
Fig.3
MALDI-TOF mass
spectra of purified trichokirin-S1 (［M+H］+=11 426.9 )
2.3 Trichokirin-S1 N端氨基酸序列分析
采用Edman降解方法对trichokirin-S1的N-端氨基酸序列进行分析， 测得它的N端15个氨基酸序列为： PRRKEGGSFDECCSE。 用Blast程序对nr数据库和其他蛋白质数据库进行检索， 未发现有相同的序列存在， 说明trichokirin-S1是一种新的蛋白质。
2.4 Trichokirin-S1对无细胞系统蛋白质生物合成的抑制活性
trichokirin-S1对兔网织红细胞裂解液的蛋白质合成抑制的测定结果见图4。 其中各蛋白质的浓度由Bradford方法测定， 以牛血清白蛋白作为标准。 为了评估trichokirin-S1的活力， 实验中对天花粉蛋白（TCS）也进行了平行的测定。 TCS是一种典型的单链RIP， 具有很强的抑制活性（IC50＝6.31×10－11
mol/L）。
trichokirin-S1的IC50为7.08×10－10
mol/L， 与其他已报道的小分子核糖体失活蛋白的活性（如： β-moschin的IC50为3×10－7
mol/L［6］； γ-momorcharin的IC50为5.5×10－8 mol/L［3］）比较，
trichokirin-S1具有较强的翻译抑制活力。
2.5 Trichokirin-S1失活核糖体机制的分析
大鼠肝核糖体与不同催化量的trichokirin-S1或TCS保温后， 将核糖体RNA从反应混合物中抽提出来， 经酸性苯胺处理， 然后用3.5％ PAGE进行电泳分析。 图5为0.04％亚甲基蓝染色后的电泳结果。 与TCS相同， 鼠肝rRNA经trichokirin-S1作用， 再经苯胺处理后， 产生一条约450 nt的特异性核酸条带（图5箭头所指条带）。 天花粉蛋白是一种典型的rRNA N-糖苷酶型核糖体失活蛋白， 它能专一性地水解真核细胞核糖体28S rRNA上4324位的腺嘌呤， 苯胺处理使RNA在脱嘌呤的位点裂解， 从而产生出一条长约450 nt的特征性核酸片段。 从上述结果可以推测， trichokirin-S1失活核糖体的机制与天花粉蛋白一致， 也是N-糖苷酶催化型的。
Fig.4
Inhibitory
activities of trichokirin-S1 and trichosanthin in a cell-free protein synthesis
system from reticulocyte lysate
trichokirin-S1,
IC50=7.08×10－10 mol/L ; trichosanthin, IC50=6.31×10－11
mol/L Data represent as x(mean)±s, n=3.
Fig.5 rRNA
N-glycosidase activity assay of trichokirin-S1 and trichosanthin
Rat liver ribosomes were treated by
trichokirin-S1 or trichosanthin and then aniline, the resulted rRNA fragments
were analyzed by 3.5% PAGE. The arrow indicates the position of α-fragment
released from the rRNA. 1, control (only treated with aniline); 2, treatment
with 20 ng trichosanthin and aniline; 3, treatment with 20 ng trichosanthin
only; 4, 6, treatment with 20 ng and 10 ng trichokirin-S1 respectively and then
with aniline; 5, 7, treatment with 20 ng and 10 ng trichokirin-S1 only.
3 讨论（Discussion）
栝楼是一种传统的药用植物， 其块根在中药中称为天花粉， 临床主要用于引产、 消肿等。 天花粉的主要成分是天花粉蛋白（tricho-santhin TCS）， 它是一种单链型核糖体失活蛋白， 具有很强的翻译抑制活性， 还具有抑制HIV-1复制的功能［12］。 另外， 在栝楼种子中已经报道了四种核糖体失活蛋白， 其中trichokirin（分子量为27 kD）［13］、 α-kirilowin（分子量为28.8 kD）［14］和β-kirilowin（分子量为27.5 kD）［15］的N端氨基酸序列与TCS有很高的同源性， 而另一种S-trichokirin的分子量仅为8 kD， 其氨基酸序列没有报道［4］。
本研究改进了纯化方法，
首次从栝楼籽中分离到一种新的具有蛋白质生物合成抑制活性的多肽trichokirin-S1。 它的分子量和翻译抑制活力都与S-trichokirin有所不同。 采用Blast程序将trichokirin-S1的N端氨基酸序列与蛋白数据库和已知的核糖体失活蛋白的N端序列进行比较， 发现它与已知的一种来源于南瓜籽的小分子核糖体失活蛋白β-moschin［6］
的N端序列和另一种南瓜籽中的贮存蛋白prepro 2S albumin［16］具有很高的同源性（见表1）， 而未发现与其它的核糖体失活蛋白（包括栝楼籽中已知的3种Ⅰ型RIPs）有同源性，
这就说明S-trichokirin不是由其他大分子的核糖体失活蛋白降解形成的， 而是一种新的蛋白质。
蛋白体是在种子成熟过程中由液泡形成的一种小泡［17］， 而trichokirin-S1存在于蛋白体中。
Table 1
comparison of N-terminal amino acid sequences of trichokirin-S1 with
β-moschin(Cucurbita moschata) and prepro 2S albumin(Cucurbita cv.)
|
Protein |
Amino acid
sequence |
|
Trichokirin-S1 |
1
PRRKEGGSFDECCSE 15 |
|
β-moschin |
1
PWRREGRSFDEEFRE 15 |
|
Prepro2S-albumin |
75
PWRREGGSFDECCRE 89 |
目前具有翻译抑制活性的多肽多来源于葫芦科植物的种子， 比较它们的氨基酸组成， 发现它们有一个共同的特征， 即富含Arg/Glu残基， trichokirin-S1的N端序列也具有这一特征， 提示在葫芦科植物种子中普遍存在这类多肽。 大分子核糖体失活蛋白的结构与功能已经研究得比较深入， 而小分子核糖体失活蛋白完整的一级结构和空间结构还未见报道。 以前报道的这类具有翻译抑制活性的多肽都是从种子匀浆中分离的， 产率较低， 一般100 g种子只能得到0.2～0.6 mg目的多肽， 如β-moschin就只有0.24 mg［6］。 我们首次采用了从种子中首先抽提蛋白体的方法来制备此类多肽， 取得了很好的效果， 最终， 每100 g种子可获得2.6 mg纯的样品。 这有利于进一步开展结构与功能的关系的研究。 而trichokirin-S1的N端氨基酸序列的确定为下一步开展基因克隆和表达的研究奠定了基础。
由于很多RIPs具有很强的蛋白质合成抑制活性， 它们已被作为“弹头”， 用于制备免疫毒素， 并已在一些癌症和自身免疫疾病的治疗中取得了较好的疗效。 而trichokirin-S1具有较强的翻译抑制活性， 也有可能被用于免疫毒素的制备。 由于它具有分子量小的特点， 免疫原性相对会较低， 因而不仅有利于免疫毒素进入病变细胞， 还有利于降低由“弹头”引起的毒副作用， 提高疗效。
References
1 Nielsen K, Boston RS. Ribosome-inactivating proteins: A plant perspective. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 2001, 52: 785－816
2 Gao W, Ling J, Zhong X, Liu W, Zhang R, Yang H, Cao H et al. Luffin-S——a small novel ribosome-inactivating protein from Luffa cylindrica. Characterization and mechanism studies. FEBS Lett, 1994, 347(2-3): 257－260
3 Pu Z, Lu BY, Liu WY, Jin SW. Characterization of the enzymatic mechanism of gamma-momorcharin, a novel ribosome-inactivating protein with lower molecular weight of 11,500 purified from the seeds of bitter gourd (Momordica charantia). Biochem Biophys Res Commun, 1996, 229(1): 287－294
4 Tai NW, Li F, Li Z, Zhuang DH, Zhang ZC. Purification and partial characterization of S-trichokirin, a new small ribosome-inactivating protein, from seeds of Trichosanthes kirilowii. Acta Biochim Biophys Sin, 2000, 32(5): 495－498
5 Ng TB, Parkash A, Tso WW. Purification and characterization of alpha- and beta-benincasins, arginine/glutamate-rich peptides with translation-inhibiting activity from wax gourd seeds. Peptides, 2003, 24(1): 11－16
6 Ng TB, Parkash A, Tso WW. Purification and characterization of moschins, arginine-glutamate-rich proteins with translation-inhibiting activity from brown pumpkin (Cucurbita moschata) seeds. Protein Expr Purif, 2002, 26(1): 9－13
7 Ying WB, Zhang ZF, Wang QC. Measurement of inhibition of protein biosynthesis in a rabbit reticulocyte lysate. Prog Bioche Biophys, 1989, 16(6): 467－470
8 Yamada K, Shimada T, Kondo M, Nishimura M, Hara-Nishimura I. Multiple functional proteins are produced by cleaving Asn-Gln bonds of a single precursor by vacuolar processing enzyme. J Biol Chem, 1999, 274(4): 2563－2570
9 Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem, 1987, 166(2): 368－379
10 Spedding G. Isolation and analysis of ribosomes from prokaryotes, eukaryotes, and organelles. In: Spedding G ed. Ribosome and Protein Synthesis: A Practical Approach, New York: IRL. Press, 1990, 1－29
11 Endo Y, Tsurugi K. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes. J Biol Chem, 1987, 262(17): 8128－8130
12 Wang JH, Nie HL, Huang H, Tam SC, Zheng YT. Independency of anti-HIV-1 activity from ribosome-inactivating activity of trichosanthin. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 302(1): 89－94
13 Casellas P, Dussossoy D, Falasca AI, Barbieri L, Guillemot JC, Ferrara P, Bolognesi A et al. Trichokirin, a ribosome-inactivating protein from the seeds of Trichosanthes kirilowii Maximowicz. Purification, partial characterization and use for preparation of immunotoxins. Eur J Biochem, 1988, 176(3): 581－588
14 Wong RN, Dong TX, Ng TB, Choi WT, Yeung HW. α-Kirilowin, a novel ribosome-inactivating protein from seeds of Trichosanthes kirilowii (family Cucurbitaceae): A comparison with beta-kirilowin and other related proteins. Int J Pept Protein Res, 1996, 47(1-2): 103－109
15 Dong TX, Ng TB, Yeung HW, Wong RN. Isolation and characterization of a novel ribosome-inactivating protein, beta-kirilowin, from the seeds of Trichosanthes kirilowii. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 199(1): 387－393
16 Hara-Nishimura I, Inoue K, Nishimura M. A unique vacuolar processing enzyme responsible for conversion of several proprotein precursors into the mature forms. FEBS Lett, 1991, 294(1-2): 89－93
17 Hara-Nishimura
I. Introduction of a disulfide bond in proglobulin molecules during the 11S
globulin biosynthesis in endoplasmic reticulum of developing pumpkin
cotyledons. Agric Biol Chem, 1987, 15: 2007－2008
_______________________________________
Received: May 9, 2003 Accepted: June 12, 2003
This work was supported by a grant from Knowledge Innovation Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KSCX2-3-06).
*Corresponding Author: Tel, 86-21-54921281; Fax, 86-21-54921011; e-mail, [email protected]